MENGOPTIMALKAN PCR

Berikut ini beberapa kasus yang sering kita jumpai dilaboratorium Genetic yang berhubungan dengan PCR. Teknik amplifikasi DNA ini telah banyak menjadikan seseorang menjadi profesor tetapi juga banyak membuat orang menjadi stress dan frustasi. oleh karena itu, pada kesempatan ini saya mencoba menuliskan beberapa kasus dan bagaimana mengatasi kasus tersebut. Semua kasus ini merupakan pengalaman saya selama satu tahun saya bekerja dilaboratorium Indonesian Biodiversity Research Center, Denpasar Bali.

KASUS :

1. Anda tidak mendapatkan pita DNA sama sekali pada saat elektroforesis, tetapi DNA marker dan control positif anda bagus.
2. Anda mendapatkan pita DNA yang terlalu tipis (konsentrasi hasil amplifikasi terlalu sedikit)
3. Anda Mendapatkan banyak pita DNA untuk satu samplenya (pita DNA berbuku-buku) dengan ukuran panjang nukleotida yang berbeda atau pita DNA smear.
4. Muncul pita DNA pada control negative.
5. Tidak muncul pita DNA, control positif, dan juga DNA ladder.

SOLUSI KASUS

1. Ketika terjadi kasus seperti ini, kemungkinan kesalahan terdapat pada saat PCR. Tidak ada masalah dengan elektroforesis karena DNA marker dan control positif menunjukan adanya pita DNA. Kesalahan pada PCR ini kemungkinan terjadi pada saat mencampurkan mastermix, ketidak cocokan metode PCR atau bisa juga kesalahan suhu annealing yang kita gunakan. Oleh karena itu, perlu dilakukan PCR ulang dengan lebih hati-hati dan teliti. Perlu dicoba metode PCR lain, bila awalnya anda menggunakan metode Gold, coba ganti dengan metode hotstart. Jika belum berhasil, anda perlu mencoba merubah suhu annealing yang anda gunakan beberapa derajat dibawah suhu awal, atau anda bisa melakukan gradient suhu annealing (melakukan satu kali PCR dengan suhu annealing yang berbeda untuk setiap tabungnya). Anda bisa membuat range gradient empat derajat kebawah dan keatas dari suhu awal (jika suhu awal 50oC lakukan gradient dari suhu 46^oC-54^oC. Jika cara di atas tidak berhasil, maka anda perlu meninjau kembali hasil ekstraksi anda, apakah anda berhasil mengekstraksi genom DNA atu tidak. Cara untuk mengetahui keberhasilan proses ekstraksi yaitu dengan merunning hasil ekstraksi kedalam gel elektroforesis (075% agarosa). Jika hasil elektroforesis menunjukan adanya pita DNA (biasanya smear memanjang) maka hal ini menunjukan keberhasilan proses ekstraksi. Cara lain untuk mendeteksi ada atau tidaknya DNA pada hasil ekstraksi yaitu dengan mengamplifikasi gen 16S. Gen ini sangat konserv sehingga kemungkinan keberhasilan proses PCR yaitu 98%. Apabila hasil elektroforesis menunjukan adanya pita DNA, berarti tidak ada masalah dengan hasil ekstraksi.  

Kemungkinan permaslahan lain yaitu terletak pada primer yang anda gunakan. Boleh jadi primer anda tidak cocok dengan urutan nukleotida  target. Untuk mengetahui hal ini, anda bisa mencoba mencari sequence DNA dari species sample anda dengan lokus gen yang sama dari gene bank (NCBI), kemudian alignment sequence primer anda dengan sequence dari gene bank tersebut. Jika sequence primer anda bisa disejajarkan dengan baik dengan sequence gene bank, kemungkinan besar tidak ada masalah dengan primer yang anda gunakan.

2. Jika pita DNA tipis, artinya proses PCR anda berjalan tetapi kurang optimal sehingga proses perbanyakan molekul DNA tidak berjalan dengan sempurna. Kekurang optimalan proses PCR ini bisa terjadi karena kurang sesuainya suhu annealing, konsentrasi DNA hasil ekstraksi terlalu sedikir atau terlalu banyak, atau bisa juga dikarenakan metode PCR yang anda gunakan kurang sensitive. Jika annealing menjadi masalah maka anda perlu melakukan gradient annealing seperti pada kasus satu. Akan tetapi jika annealing anda tidak bermasalah (misalnya: suhu annealing tersebut telah menghasilkan pita DNA yang bagus untuk beberapa individu dengan species yang sama) maka permasalahan kemungkinan terletak pada konsentrasi DNA hasil ekstraksi. Anda perlu melakukan gradient konsentrasi DNA. Gradient bisa dilakukan dengan menambah volume DNA hasil ekstraksi atau mengencerkannya. Anda bisa memulai gradient dari pengenceran 1:10, 1:100, 1:1000, kemudian 1 µL, 2 µL, dan 3 µL. Dari semua itu, mana yang bisa mengahsilkan pita terbaik  maka itulah volume DNA yang optimal anda gunakan. Akan tetapi jika kesemuanya menghasilkan pita DNA yang sama-sama tipis, maka permasalahan bukan pada konsentrasi DNA hasil ekstraksi. Mungkin anda perlu mencoba metode lain yang lebih sensitive seperti Hotstart. Metode Hotstart lebih sensitive jika di bandingkan dengan metode gold. Metode lain yaitu dengan menggunakan PCR kit yang telah diramu langsung oleh pabrik sehingga anda hanya tinggal memasukan DNA hasil ekstraksi anda.
3. Pita DNA berbuku-buku terjadi karena kurang spesifikanya penempelan primer sehingga terjadi pengamplifikasian daerah yang bukan menjadi target. Hal ini terjadi karena kondisi suhu penempelan yang terlalu rendah atau kurang spesifiknya primer yang digunakan. Untuk mengatasi hal ini, langkah awal yang diambil yaitu dengan melakukan gradient suhu annealing sehingga diperoleh suhu annealing terbaik. Jika permaslahan terdapat pada primer maka gunakan primer lain yang spesifik mengkopi lokus yang sama. Primer yang kurang spesifik biasanya karena primer yang terlalu pendek. Oleh karena itu, primer yang baik memiliki sekitar 25-30 nukleotida. Selain itu, bisa juga anda lakukan pengurangan jumlah enzim yang anda gunakan. Hal ini dilakukan dengan asumsi semakin sedikit enzim amplitaq polymerase, maka semakin sedikit pula molekul DNA yang disintesis sehingga mengurangi kemungkinan teramplifikasinya daerah lain yang bukan menajdi target. MgCl₂ dalam PCR berfungsi menspesifikan kerja dari enzim taq polymerase. Oleh karena itu, penambahan volume MgCl₂ juga akan lebih menspesifikan kerja enzim amplitaq polymerase dalam mengamplifikasi molekul DNA target.

Pada kasus lain, boleh jadi DNA yang berbuku-buku itu diakibatkan karena adanya kontaminasi pada hasil ekstraksi anda. Kasus ini terjadi biasanya ketika anda memiliki 10 sample, beberapa sample telah positif dengan hasil yang bagus, sedangkan ada 1 atau dua sample saja yang berbuku-buku. Langkah pertama yang dilakukan yaitu cek spesies sampel yang berbuku-buku tersebut, cek pula lokasi dan tanggal pengambilan sampel. Jika ternyata sama spesies, sama lokasi, dan sama waktu pengambilannya, hal ini kemungkinan besar terjadi kontaminasi pada hasil ekstraksi sampel yang berbuku-buku. Jika hal ini terjadi, solusi yang bisa dilakukan yaitu dengan melakukan ekstraksi ulang sample yang mengalami kontaminasi tersebut.

4. Ketika muncul pita pada control negative hal ini menunjukan adanya kontaminasi pada proses PCR maupun ekstraksi yang anda lakukan. Langkah awal mengatasi hal ini yaitu dengan mengulang PCR dengan lebih berhati-hati dan lebih menjaga kesetrilan proses. Apabila telah berhati-hati dengan sangat maksimal akan tetapi tetap terjadi kontaminasi, kemungkinan selanjutnya yaitu pada reagent yang anda gunakan. Untuk lebih mudahnya dan demi menghemat enzim yang anda gunakan saya sarankan anda mengganti semua reagen yang anda gunakan. Ambil stok reagen yang baru, yang masih benar-benar steril.
5. Apabila hasil elektroforesis tidak menunjukan pita DNA sama sekali, bahkan DNA marker, dan control positif tidak muncul pita DNA, hal ini menunjukan adanya masalah pada proses elketroforesis. Kesalahan boleh saja terjadi saat pembuatan gel, anda lupa menambahkan etidium bromida sehingga tidak terbentuk warna pada DNA. Untuk mengatasi masalah ini simple saja, anda tinggal menulang elektroforesis dan tinggal lihat hasilnya. Kemungkinan besar kesalahan pada tahap ini sangat kecil akan tetapi tidak menutup kemungkinan bisa terjadi.