PROTOKOL HOTSTART PCR

PROTOKOL PCR HOT START

1.       Siapkan sampel produk ekstraksi, kemudian isi form PCR. Hitung jumlah sampel dan buat mastermix untuk jumlah sampel ditambah control negative n tambah 1 untuk eror pipetting. Misalnya kita punya sampel 5, tambah control negative 1 dan eror 1 maka kita buat mastermix untuk 7 tabung. Jika telah punya hasil yang positif, kita juga bisa tambahkan control positif. Tambahkan 1 eror untuk setiap kelipatan 10.

2.       Siapkan semua reagen ( H2O, Buffer PCR Red, DNTPs, MgCl2, dan primer forward dan revers.

3.       Ambil 2 buah tabung strip lengkap dengan tutupnya. Beri label inisial, tanggal, dan primer. Kemudian tulis nomor 1 sampai 8 pada leher tabung strip. Tabung strip yang satunya biarkan tanpa label. Siapkan 2 tabung eppendrof 0,5 mL dan beri label MM1 dan MM2.

4.       Sekarang, kita cairkan semua reagen (biasanya disimpan di frezer, pastinya beku, makanya perlu dicairkan) dengan menggenggam erat dan pastikan semuanya mencair dengan sempurna. Kocok-kocok untuk memastikan tidak ada komponen yang terendap didasar tabung.

5.       Sebelum memipet reagen, selalu mix terlebih dahulu dengan menggunakan pipet.

6.       Ambil H2O sesuai hitungan yang telah kita dapat, dan masukan ke tabung MM1 dan juga ambil untuk MM2 (volume sesuai protocol)

7.       Kemudian ambil juga untuk buffer MM1 dan MM2. Kemudian tutup MM2 dan sekarang kita bekerja dengan MM2.

8.       Ambil dNTPs, MgCl2 Primer 1 dan 2, kemudian mix dengan menggunakan pipet.

9.       Ambil 14 µL MM1 dan masukan kedalam setiap lubang tabung strip yang telah kita beri label.

10.   Masukan 1 µL DNA hasil ekstraksi kedalam tabung strip yan berisi MM1 sambil di mix.

11.   Pastikan dalam tabung tidak ada gelembung. Jika perlu di spin.

12.   Selanjutnya buka penutup tabung strip yang berisi MM1 dan DNA, dan tutup hanya pada lubang 1 dan 8.

13.   Sekarang kita bekerja dengan MM2. Dan kita ambil enzim taq red, kita msukan ke dalam tabung MM2 dan kita mix.

14.   Bagi kedalam setiap tabung strip yang masih kosong dan tidak dilabel tadi sebanyak 11 µL MM2.

15.   Selanjutnya siapkan multi chanel pipet, setting pada volume 11 µL. dan tipsnya.

16.   Lets go to thermocycler…. Nasukan tabung strip yang berisi MM1 dan DNA kedalam thermocycler, tutup dan running mesin dengan program Hotstart. Tunggu hingga suhu mesin menunjukan suhu 80. Tekan PAUSE. Buka penutup strip tabung.

17.   Buka kembali mesin, ambil MM2 sebanyak 11 µL  dengan multichannel pipet, kemudian masukan dalam tabung strip yang berada dalam mesin, Mix dengan pipet, kemudian tutup kembali tabung dan juga mesin serta pencet kembalu run. (usahakan lakukan dengan cepat dan tepat. Semakin lama kerjanya, enzim kurang bekerja)

18.   Tunggu hingga proses selesai. Dan beres dehhhhh.